產(chǎn)品規(guī)格

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

外泌體是由活細(xì)胞分泌的具有生物活性的膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，直徑在50-150nm左右，并且不能自行復(fù)制的具有脂質(zhì)雙分子層的小囊泡。外泌體廣泛分布于細(xì)胞上清，血液，尿液，腦脊液，唾液，滑液，羊水，牛奶中，在植物與細(xì)菌中也有分布。外泌體含有多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA和RNA等物質(zhì)，在細(xì)胞間通訊、物質(zhì)運(yùn)輸和免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。

通用型外泌體純化試劑盒是一款基于尺寸排阻色譜法（SEC法）原理的外泌體純化試劑盒，原理是當(dāng)顆粒進(jìn)入多孔多糖樹(shù)脂時(shí)，更小的顆粒被困在孔隙中，它們從柱子中出來(lái)的時(shí)間被延遲。當(dāng)液體流出柱子時(shí)，連續(xù)收集餾分。顆粒根據(jù)大小不同分布在各個(gè)餾分中，較大的顆粒先離開(kāi)柱子，較小顆粒，蛋白等小分子后離開(kāi)柱子。顆粒不與樹(shù)脂發(fā)生化學(xué)結(jié)合，保證分離穩(wěn)定性和可重復(fù)性。該試劑盒具有快速、高效、獲得的外泌體純度高，形態(tài)完整等特點(diǎn)，可用于電鏡分析、NTA粒徑分析、核酸分析、蛋白分析、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等。

  本試劑盒適用于血漿血清、細(xì)胞上清、尿液、唾液和腦脊液等澄清度高的非復(fù)雜生物樣本，包含配套的SEC純化柱，純化濾管，濃縮超濾管及再生液。本試劑盒在細(xì)胞上清液樣品中達(dá)到外泌體回收率高達(dá)91%，雜蛋白去除率99.24%。

產(chǎn)品組成

注： SEC純化柱(Exosome Purification Column)經(jīng)過(guò)處理及正確保存可重復(fù)使用，外泌體純化濾管（Exosome Purification Filter）不可重復(fù)使用。

保存條件

  常溫運(yùn)輸存儲(chǔ)，有效期 1 年。

使用方法

需自備試劑和耗材：

（1）試劑：①無(wú)菌1×PBS溶液（0.22 μm 濾膜過(guò)濾）；②填料保存液：20%乙醇（超聲脫氣，或配置后靜置過(guò)夜）；③去離子水（0.22 μm 濾膜過(guò)濾）

注：以上試劑使用前需平衡到室溫。

（2）簡(jiǎn)單裝置及耗材：①重力純化柱支架或鐵架臺(tái)；8只餾分EP收集管：1.5 mL EP管

一．樣本預(yù)處理：

細(xì)胞上清：

（1）收集細(xì)胞上清10-50 mL，對(duì)細(xì)胞上清液離心（4000 xg，10 min），棄沉淀保留上清液；

（2）上清液使用0.22 um濾膜過(guò)濾；

（3）過(guò)濾后用15 mL超濾管進(jìn)行濃縮，濃縮體積比為1:20—1:50，收集濃縮液備用（試劑盒配備有10KDa超濾管，超濾管使用方法見(jiàn)本司超濾管產(chǎn)品官網(wǎng)）。

注：上樣樣品體積為0.5 mL樣本，過(guò)柱純化過(guò)程會(huì)對(duì)樣本進(jìn)行一定的稀釋?zhuān)虼藨?yīng)盡量保證樣品中有足夠多的囊泡，推薦上樣樣品BCA蛋白濃度大于5 mg/ml（建議使用外泌體專(zhuān)用無(wú)血清培養(yǎng)基，提高細(xì)胞上清中外泌體的含量）。

尿液：

（1）采集中段晨尿約10-50 mL，對(duì)尿液離心（4000 xg，10 min），棄沉淀保留上清液；

（2）上清液使用 0.22 um 濾膜過(guò)濾；

（3）過(guò)濾后用 15 mL超濾管濃縮，濃縮體積比為1:20—1:50，收集濃縮液備用。

二．外泌體分離

（1）柱平衡：若柱保存在4℃，室溫放置30 min，置于重力柱支架上（自備），柱下部放置廢液收集燒杯。實(shí)驗(yàn)前確保SEC柱子處于室溫后再打開(kāi)頂部柱塞和底蓋，將管中保存液排空至底部出口無(wú)液體流出，向柱中加入15mL 無(wú)菌PBS洗滌填料（可分次加入），可讓液體全部流出。

（2）上樣：底部無(wú)液體流出時(shí)加入0.5 mL樣品（樣品不足0.5 mL用PBS稀釋混勻補(bǔ)足），讓樣品全部進(jìn)入篩板。

（3）空隙體積：當(dāng)樣品全部進(jìn)入篩板，底部無(wú)液體流出后加入2.5 mL PBS等待PBS流過(guò)直至無(wú)液體流出，此過(guò)程底部流出0.5 mL+ 2.5 mL的體積為空隙體積（可丟棄的洗脫液）

（4）收集外泌體餾分：上步驟底部液體完全流出后，加入0.5 mL PBS，使用EP管收集流出液，收集體積為0.5 mL，標(biāo)記為餾分1。餾分1完全流出后再加入0.5 mL PBS，收集流出液為餾分2。重復(fù)此步驟收集4個(gè)餾分（每一次收集需等待上一個(gè)餾分完全流出后才能加PBS），純度最佳為前3個(gè)餾分即1.5 mL 體積，高回收率推薦合并前4個(gè)餾分即 2mL 體積。

（5）過(guò)濾或濃縮外泌體：將收集的外泌體餾分轉(zhuǎn)入 Exosome Purification Filter管（EPF）中，于以4000 xg離心 10 min，離心后收集EPF管底的液體，此液體即為過(guò)濾的外泌體（注：EPF管不可重復(fù)使用）；如需要，可使用超濾管對(duì)收集產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步濃縮富集。

三．SEC柱清洗再生和儲(chǔ)存

（1）柱再生：收集到所需體積后，用10 mL 再生液進(jìn)行清洗，再用20 mL PBS 清洗，隨后可進(jìn)行第二次上樣。

（2）柱儲(chǔ)存：如果要儲(chǔ)存以備將來(lái)使用，先用10 mL 再生液進(jìn)行清洗，再依次用 20 mL PBS、20 mL去離子水20 mL的20%乙醇清洗，清洗結(jié)束后蓋上底蓋，倒入保存液（20%乙醇），蓋上頂蓋密封可置于4 ℃或常溫儲(chǔ)存。

注：再生液為堿性，避免再生液清洗后直接添加去離子水或 20%乙醇來(lái)平衡純化柱，防止樹(shù)脂床內(nèi)的鹽沉淀并損壞柱，去離子水清洗可進(jìn)一步洗去平衡過(guò)程中產(chǎn)生的鹽，防止鹽與 20%乙醇直接接觸產(chǎn)生結(jié)晶。

結(jié)果展示：

圖1：純化過(guò)程每0.5mL餾分NTA外泌體顆粒濃度，及餾分BCA蛋白濃度

圖2：純化后外泌體TEM 圖及外泌體WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

注意事項(xiàng)

1．為了您的自身安全，實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)做好有效防護(hù)。

2．為避免色譜柱中過(guò)濾器堵塞，建議對(duì)其他粘度較高的的生物樣品進(jìn)行過(guò)濾或離心處理，以去除較大的顆粒物。

3．當(dāng)外泌體餾分用于后續(xù)高通量測(cè)序或者其他組學(xué)分析時(shí)，為避免交叉污染，建議使用新柱。

4．請(qǐng)注意使用過(guò)程中勿將柱子從高處摔落或摔打?qū)е轮菜榱眩疵撨^(guò)程避免柱內(nèi)液體流盡后，填料干放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

5．柱再生過(guò)程中不可避免會(huì)產(chǎn)生鹽，鹽沉淀影響填料性能，每根柱子重復(fù)使用次數(shù)建議不超過(guò)5次。

6．再生液為堿性，具有一定腐蝕性，請(qǐng)務(wù)必小心使用，做好實(shí)驗(yàn)防護(hù)，若沾到皮膚請(qǐng)用大量水清洗。

7．本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)！